最适测定条件与条件的优化
国际临床化学联合会（IFCC）和中华医学会检验分会均推荐选择在“最适条件”下测定酶活性浓度.所谓最适条件是指能满足酶促反应速度达到最大反应速度所需的条件.包括：①合适的底物和最适底物浓度；②理想的缓冲液种类和最适离子强度；③反应液的最适pH；④最适反应温度；⑤合适的辅因子、激活剂浓度；⑥若是酶偶联反应,还需要确定指示酶和辅助酶的用量；⑦合理的测定时间,包括延滞期尽量短暂,有足够的线性期；⑧合适的样品与反应试剂的比例；⑨足够的检测范围；⑩尽量去除各种抑制剂等.
1．底物浓度 除选择适合的底物外,在实际应用中更多考虑的是底物浓度.由于[S]与反应速度V成双曲线关系,在酶活性测定时,要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比.[S]范围一般选择在10～20Km为宜,此时反应速度基本达到最大反应速度,测定的误差在可接受范围.
2．酶浓度 在反应条件一定时,酶浓度与反应速度成正比.按照中间产物学说,只有[S]>>[E]时,酶才能被底物分子饱和,反应速度才能达到最大值.因此当标本酶活力过高时,应将标本适当稀释后再加以测定.
3．温度 不同的酶最适温度可以不同,多数酶的最适温度在37～40℃,高于或低于最适温度,酶活性都降低.目前,酶活性的测定温度尚未统一,但常规实验室多使用37℃.温度对酶促反应的影响程度通常用温度系数(Q10)表示.温度系数指温度每升高10℃,化学反应速度增加的倍数.Q10通常为l～2.由温度系数得知,温度的变化对酶活性有着重要影响,因此要求酶活性测定要在恒温条件下进行,温度波动要控制在±1℃.
4．离子强度和pH值 在最适pH时,酶的活性最强,高于或低于最适pH,酶的活性都降低,多数酶的最适pH在5～8之间.在测定酶活性时,要求缓冲液具有足够的缓冲容量,以便使pH值保持稳定.血浆或血清标本含有多种缓冲溶质,具有较强的缓冲能力.为了防止血浆或血清标本缓冲溶质对反应液酸碱度的影响,使pH不致偏离设定值,标本用量不宜过大,血浆或血清标本体积／反应液体积≤1／10为宜.
5 辅助因子 某些金属离子和维生素类辅酶是结合酶的辅助因子,例如Zn2+是羧基肽酶的辅基,Mo6+是黄嘌呤氧化酶的辅基,NADH是不需氧脱氢酶的辅酶.这些酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性,因此在酶活性测定时,就要保证辅基或辅酶的供给.
6．激活剂 有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高,例如Mg2+是肌酸激酶的激活剂,Cl-是淀粉酶的激活剂.因此在酶活性测定时,也要满足酶对激活剂的需要.
7．抑制剂 酶的抑制可分为不可逆抑制和可逆抑制,后者又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制.重金属离子和砷化物对巯基酶的抑制、有机磷对羟基酶的抑制属于不可逆抑制；丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制、磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的抑制属于竞争性抑制；哇巴因对Na+,K+-ATP酶的抑制属于非竞争性抑制.抑制剂使酶活性降低,在测定酶活性时,应避免抑制剂的影响.
综上所述,测定酶活性时,最适条件的选择应该遵循最适底物浓度、最适温度、最适pH值、满足辅助因子和激活剂、避免抑制剂的原则.
