挑战是一种特殊的玩法,游戏开始时玩家通常会获得一些指定的道具,但坏处是玩家每一层都会受到诅咒,而且没有宝物房.游戏里一共有二十个挑战：
1.Pitch Black漆黑一片
你看不见你的血量,房间的光线更暗.
有宝物房.
终点：妈腿
解锁方式：自带
解锁：Rune of Hagalaz(摧毁房间里所有可被破坏的物体;一次性可拾取道具)
2.High Brow达官显贵
起始道具：Number One(尿),E.Coli(翔之触),Butt Bombs(翔炸弹),Enema(将所有敌人变成翔;主动),Petrified Poop(饰品)
无宝物房.
终点：妈腿
解锁方式：自带
解锁：Rune of Jera
3.Head Trauma头部创伤
起始道具：Tiny Planet(眼泪围着你转),Soy Milk(大幅降低攻击,将射速提到堪比technology 2的射速水平),Small Rock(加攻击) 和 Iron Bar(有几率射出铁眼泪来困惑敌人)
无宝物房.
终点：妈腿
解锁方式：自带
解锁：Rune of Ehwaz(生成一个陷阱门,同We Need To Go Deeper)
4.Darkness Falls黑暗降临
起始道具：Pentagram(加攻击),Dead Bird(受到攻击放出可以攻击的小鸟),Whore of Babylon,Razor Blade(自残来加攻击力),Sacrificial Knife(生成一个匕首在你身边转) 和 Dark Matter(使被打到的敌人受到恐惧效果)
无宝物房.
终点：撒旦
解锁方式：未知
解锁：Rune of Dagaz
5.The Tank坦克
起始道具：Lard(加两格血上限),Infamy(减免一定的伤害),Yum Heart(回复1格血;主动,4充能)和 Thunder Thighs(加1血上限,减速,并使你可以通过走到环境物上来摧毁它们)
无宝物房.
终点：妈腿
解锁方式：解锁抹大拉
解锁：Rune of Ansuz(显示所有地图,包括隐藏房)
6.Solar System太阳系
起始道具：Transcendence(移除身体,并获得飞行),Distant Admiration(生成一个红苍蝇在你稍远的地方转),Forever Alone(生成一个蓝苍蝇在远的地方转),Halo of Flies(生成两个白苍蝇在你身边转)
无法发射眼泪(环绕物是你唯一的攻击手段)
无宝箱房.
终点：妈心
解锁方式：在身边满环绕物(肉,苍蝇)的情况下通关
解锁：Rune of Perthro(D6!重新随机当前房间内的道具)
7.Suicide King自杀之王
起始道具：Ipecac(将攻击方式替换为用抛物线投出爆炸性的带毒眼泪),Mr.Mega(增加爆炸威力),My Reflection(使发出的眼泪像回旋镖一样返回人物),随机的胶囊
无宝物房.
终点：以撒
解锁方式：解锁My Reflection
解锁：
8.Cat Got Your Tongue无言以对
起始道具：Guppy*s Head(产生蓝苍蝇),Guppy*s Tail(提升清理完房间时掉落箱子的几率),Guppy*s Hairball(一个跟在你身后的毛球,通过将其向前甩来攻击;杀死敌人后会变大,并提升攻击力)
无法发射眼泪(开始时只能通过毛球来攻击)
终点：妈腿
解锁方式：通过收集齐猫套变成Guppy
解锁：Rune of Alzir(获得长时间的无敌效果)
9.Demo Man破坏者
起始道具：Dr.Fetus(将攻击方式替换为向前投出一个炸弹),Remote Detonator(按下空格键来引爆炸弹,否则炸弹不会爆炸(对Dr.Fetus发出的炸弹无效)),Matchstick(饰品)
无宝物房.
终点：妈心
解锁方式：解锁Dr.Fetus
解锁：The Chaos Card
