克隆什么基因?
为什么克隆基因?
用途是什么?
再问： 选择一个林业树种的目的基因（需命名，如控制苹果果皮颜色基因Mdfsc（Malus domestica fruit-skin color-related gene）），从核酸（主要是RNA）的提取纯化、目的基因的分离克隆、目的基因的瞬时表达模式、原核表达、遗传转化（即通过转基因植物的功能研究）等几个方面设计一套实验方案，以技术路线图示结合文字描述为佳。关键的实验步骤（如RT-PCR扩增目的基因核心片段的简并引物如何设计？）须阐述清楚。
再答： 1. 目的cDNA的获得。使用试剂盒或者trizol法提取总RNA，然后使用反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA。 2. RT-PCR扩增。以上步得到的cDNA为模板，进行RT-PCR反应，扩增目的cDNA。（引物设计使用软件primer或oligo等等，加上特定的限制性内切酶位点。） 3. PCR产物跑琼脂糖凝胶，切胶回收（有试剂盒） 4. 根据目的的不同，选择不同的载体，与目的回收产物一起进行酶切 5. 用连接酶把酶切片段连起来，测序，保证方向和阅读框不变。 6. 根据不同的目的，还有可能要通过设计特定的引物将目的cDNA与标记基因（如GFP）连起来 7. 转化（大肠杆菌或农杆菌），用相应的选择性培养基培养 8. 挑取阳性菌，验证。 9. 提质粒，测序。 10. 如果是转化植株的菌，通过侵染植株或愈伤组织获得转基因植株。
