继代培养怎样防止真菌污染?

1 细菌污染简介 1.1 污染的原因污染的原因在培养过程中污染是经常发生的.它会导致培养基和培养材料 上滋生杂菌 ,最终组培失败. 在科研和商品化生产种苗中 ,污染率是与经济效益 紧密相关的一个重要指标 ,控制污染率无疑是一项提高经济效益、 节约材料的 有效途径之一.因此 ,探讨和重视污染在科研和生产中显得十分重要. 1.2 操作污染和环境污染操作污染和环境污染指真菌污染和细菌污染.真菌污染主要来源于环境, 细菌污染主要来源于接种材料及工具.此类污染可通过如下措施加以克服： 1.2.1 改善环境条件每次接种前应对接种室的地面进行清洁卫生工作,并用 75%的酒精喷雾使空 气中的灰尘沉降,并用紫外线灯在黑暗中照射 20~30 分钟.接种前工作台面要用 新洁尔灭或 75%酒精擦洗,使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效.但 它应置放在洁净的房间,窗户密封,并定期清洗过滤膜,以延长使用寿命.培养 室的相对湿度应控制在 70%左右,相对湿度太高时可以用抽湿机除湿.在接种结 束时,应进行地面清洁卫生工作,即先打扫一遍,再用湿布擦过,并定期用甲醛 熏蒸接种室. 1.2.2 无菌操作和无菌操作技术工作人员使用的工作服、 帽子、 口罩等, 要经常保持干净, 并定期进行消毒. 在接种前要剪除指甲,并用肥皂或洗衣粉溶液擦洗,最好再在新洁尔灭溶液中浸 泡 10 分钟,后用 75%的酒精擦手,并用 75%的酒精擦拭母种瓶表面进行消毒,以 防把微生物带进超净工作台.同时要求工作人员在接种时,最好不要感冒咳嗽和 说话.污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染,这种细菌为芽孢杆菌.法国林 木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌,它外被荚膜,耐高温,一般消毒剂难以杀死. 它可随培养材料、用具等传播；也可出现在培养基表面,或呈滴形云雾状存在培 养基内,若出现时应严格灭菌,清洗和消毒用具,并更换消毒酒精. 操作人员操作动作要熟练、动作快、规范,这样可以缩短操作时间,减少 污染.因为有很多组织培养的失败,从材料、培养基条件等方面检查均无问题, 只是由于操作技术不熟练,如脱毒培养抽取茎尖很小,操作时间长了就会使茎尖 失水变干,或不慎感染杂菌,再同时接种的环境又不是绝对无菌的. 1.2.3 严查接种材料淘汰被细菌污染过的接种材. 1.2.4 经常检查消毒锅的灭菌质量消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅.因冷热空气作用的负压效应,使外 界环境的冷空气倒吸入已灭菌好的培养瓶内引起真菌污染,为避免该现象的发 生,消毒后培养瓶应留在锅里,等冷却后才出锅.如果出现培养基造成的污染, 就要及时地检查灭菌锅的性能或其他的问题. 1.2.5 检查培养容器是否存在问题培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等,塑料盖用久了易老化,密 封性差,也会造成污染.同时,培养瓶在使用之前要洗净（包括瓶内瓶外）,灭 好菌的培养瓶不要放在空气中太久,一般出锅后 1~2 天内接完种最好,以减少培 养瓶表面的微生物引起的污染. 2 内源性污染的控制在植物组织培养中,由于材料内部的内生菌不能被一般的表面消毒方法所 2.1 内源性污染的含义清除,随着材料进入培养过程,引起的污染称为内生性污染或内源性污染. 2.2 内源性污染的种类从已有报道看,被鉴定的种类主要有：黄单胞菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌 属、土壤杆菌属、棒状杆菌属、欧文氏菌属等.真菌主要有霉菌.目前在各种农 作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过 129 种（隶属于 54 个属）对于 一种植物而言,从中分离到的内生真菌和内生细菌通常为数种至十种,有的还到 百种之多,其主要出现在热带植物组织中. 2.3 内源性污染的分布内源性污染主要发生在那些生长在高温多雨的热带、 亚热带和多年生木本植 物,尤其是在污染较严重的地区,如工业区,人口众多的城市,公路边等. 2.4 内源性污染的症状和危害性在初代培养中,表面细菌引起的污染通常在 2~3 天就能在外植体周围或培养 基表面形成明显的如水污状、 油污状、 气泡或干缩的红、 黄、 乳白等颜色的菌落. 而在外植体培养后 3~5 天内并未发现细菌污染, 以后则不继出现明显的或不明显 的细菌菌落,就可能是由内生细菌引起的污染. 在某些植物初代培养或前几代的继代培养中存在的污染,并不形成明显的菌 落而只在培养基内部形成“丝状物”,“晕状物”,不易被肉眼发现的,如不仔 细观察很容易忽视,随着继代培养次数的增加,菌量不断的积累,就会在培养基 上表现出来.对于这种情况,我们可以利用背光检查法去观察发现它. 内生细菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败,增殖效率降低,培养 物生长减慢,玻璃化苗增多等.在后期导致试管苗移栽困难或死亡,有时污染也 会引起培养物的遗传变异. 3 细菌污染的防止措施 3.1 外植体的消毒 3.2.1 预栽管理一般来说,温室内盆栽的植株比室外栽培的植株含菌少,为了能更好的降低 污染率,我们要把室外栽培变为室内盆栽.要求：盆栽用土应使用不含有机质及 经消毒的清洁土壤, 尤其是要采集地下材料时, 须用经过消毒蛭石等作栽培基质； 施用无机肥,并对植物喷洒杀虫剂和杀菌剂.不便移栽的,可套塑料袋,待长出 新枝条后,再采样接种. 3.2.2 外植体预处理 3.2.2.1 促发新枝将田间采集的枝条用水冲洗干净后插入无糖的培养液或自来水中,使其发 枝,后以这种新抽的嫩枝作为外植体,可大大减少内源菌的污染. 3.2.2.2 黄化处理在无菌条件下,对采自田间的枝条进行暗培养,待抽出徒长的黄化枝条时取 材,也可减少污染.这方法曾用于成年栗树的枝条和仙客来实生苗,减少了内生 细菌的污染. 3.2.2.3 3.2.2.3 热击处理如将美丽百合的鳞茎外植体放入试管中进行 43 聂氏度热击处理,罗伯利槭 的休眠芽进行 42.5 聂氏度或 45 聂氏度热击处理；草莓茎尖在 30 聂氏度处理可 得到脱毒苗 . 3.2.2.3 用抗生素进行处理庆大霉素和链霉素,属于氨基糖苷类型,它们与细菌中的 30S 核蛋白体亚单 位结合,抑制细菌的酸苷油酯合成,通过阻断其正常代谢途径使微生物致死.如 相思树的茎段灭菌时, 用皂液刷洗和 75%酒精杀菌后, 转入不同的抗生素溶液中, 在摇床上振荡过夜,再用 75%的酒精和 0.1%升汞分别杀菌 1 分钟和 15 分钟,灭 菌效果（如下表）其中以抑制剂 ANB1 和 ANB2 的抑制效果较好,未污染的分别为 63.3%和 76.7%；成活率分别为 60.0%和 50.0%. 不同抗生素预处理对相思树茎段的影响 接种茎段 处理 ANB1 ANB2 头孢拉定 林肯霉素 庆大霉素 对照 CK 数 30 30 30 30 30 30 茎段数 19 23 0 7 15 2 未污染的 比例（%） 63.3 76.7 0 23.3 50.0 6.7 茎段数 18 15 0 5 8 1 成活的 比例（%） 60.0 50.0 0.0 16.7 26.7 3.3 3.2.3 改进灭菌方法 3.2.3.1 真空减压灭菌利用真空减压抽走植物组织中的空气,使消毒剂容易侵入,从而增强杀菌效 果. 经对万年青茎段的实验可知道： 减压灭菌的效果明显优于常规灭菌 （如下表） , 未污染率从常规的 6.7%升到 60.0%,成活率从常规的 3.3%升到 43.3%. 常规灭菌与真空减压来灭菌对万年青茎段防止效果比较 处理 接种茎段 数 常规灭菌 减压灭菌 30 30 未污染的 茎段数 2 28 比例（%） 6.7 60.0 成活的 茎段数 1 13 比例（%） 3.3 43.3 磁力搅拌、 3.2.3.2 磁力搅拌、超声波振动法为减少在外植体表面形成的气泡,在浸泡时还可采用磁力搅拌和超声波振 动的方法.如对月季、苹果的枝条,用 0.1 升汞磁力搅拌 15~20 分钟,再用无菌 水磁搅拌清洗,污染率有所下降. 3.2.3.3 灼烧灭菌利用火烧的方法杀死外植体表面的所有微生物,以不伤害所要使用的组织 或细胞为度.如将马蹄莲的根在 95%的酒精中浸泡 1 分子钟后,短时间内灼烧 2 次,比常规消毒的污染率降低 60%.这种方法已用在绿色荚果、蒜的小鳞茎和银 白杨芽的消毒. 3.2.3.4 酸化培养基除了欧文氏菌属外,大多数细菌在介质 PH 小于 4.5 时不能生长.在紫苑属、 鸢尾属、蔷薇属植物组织中,将培养基的 PH5.8 降到 3.9~4.3,可防止大量的细 菌污染. 3.2.3.5 其他多次消毒如先用皂液对番木瓜侧芽浸泡 20~30 分钟,再用 0.1%高锰酸钾溶 液处理 5 分钟,然后进行消毒处理,然后用 4%次氯酸钠加 0.1%升汞消毒,最后 用无菌水洗,污染率降低为 50%左右；使用混合消毒液是用几种消毒液(如多菌 灵、抗坏血酸、柠檬酸、氯霉素等混合)对外植体时行处理,以降低污染率；在 培养基中加入其他抑菌剂（如 50%多菌灵、70%甲基托布津和 25%甲霜灵）抑菌率 也非常高. 3.2.4 继代培养中污染的控制初代培养获得的无菌材料在后期或继代培养也可能出现污染, 这一方面是由 于操作不慎的原因, 另即是由于初代培养中使用了营养相对简单的培养基有可能 使污染不易表现出来,有时继代材料在培养室则可能被螨传播的真菌污染.这类 污染可以从以下 2 个方面进行防止.(1)扩大繁殖时应有合理程序.在获得的无 菌培养物之后,应将其中一部分作为“原种”保存起来,分批繁殖和复检后再大 规模生产.（2）可通过在培养基中加入抗菌剂来防止.多菌灵用于金线莲组织 培养的抑菌促生长,培养物不受微生物污染,灭菌率为 98%以上,无白化苗,生 长健壮,不过这种方法不能广泛使用,因为有些植物在抑菌素会受到毒害,如叶 片变小、变黄和不能分化等.还有使用时要调到适合的浓度. 对植物中的内生细菌,由于它潜伏得较深,表面消毒方法无法将其消灭. 有时在外植体的初级培养中,包括前几代的继代培养,往往在培养基上不易被发 现,随着继代次数的增加,菌量慢慢累积发展,才在培养基上显现出来.可通过 在培养基中添加抗菌素,降低 PH 值等措施防止和减少细菌等内生菌的污染 . 植物材料中的内生菌,也可采用反复茎尖培养或分生组织培养的方法来脱 除.因致病菌在植物体内的分布不均,且是通过维管束传播的,故茎尖分生组织 是不带菌的.因此,通过反复的茎尖培养和分生组织培养,既可脱内生菌又可脱 毒. 3.2.5 减少培养基中的有机成分培养基中有机成分的存在是污染产生的重要原因,去除有机物是减少污染 的一条途径.在阿月浑子的组织培养中,除去培养基中的 VB1、VB6、烟酸等（保 留肌醇）有机成分,经 2~3 代培养后,能抑制细菌生长,对丛生芽生长增殖没有 影响.原因是这些都是某些细菌生长的必须物质,去除这些有机成分后,细菌无 法生长发育而慢慢死亡或减少.经试验,在罗汉果生根培养中,除去糖成分,在 罗汉果苗生根时,可适当加强光照,同时在接种时,要适当地留一些小叶片,但 不能让叶片接触到培养基,生根苗的生长都良好.由日本的古在丰树教授首创的 无糖组织快繁技术则全部除去培养基中的有机成分, 输入可控制量的 CO2 气体作 为碳源,并通过控制环境因子,促进植株光合作用速率,使之由异养型转变成自 养型,因而植物长势良好,污染率明显降低. 4 总结在植物组织培养中,一般的污染较容易控制,要达到接种的无菌环境条件,无菌 操作要求和无菌操作水平.而内源菌则较难控制,要求全部杀死植物表面和组织 中的微生物, 一般的消毒方法是不能完成的. 通过先对外植体植物进行预栽管理、 外植体的预处理,并在这基础上,改进消毒方法, （如真空减压法、酸化培养基、 灼烧法等）,也可除去培养基中的有机成分,这些措施都能降低由内源菌引起的 污染.当然,在植物组织培养中,控制污染的方法是可灵活多变的,只要能减少 污染,不会发生培养物的遗传变异,实现工厂化快繁,降低成本,能在市场竞争 中占有一席之地即可.