恢复一根已受污染的高效液相色谱柱的关键在于了解污染物的性质,然后寻找一种合适的溶剂将其去除.如果污染物是由于一些强保留物质的多次进样积聚而产生,一个除去这些污染物的简单的冲洗过程往往会使色谱柱恢复性能.有时,在经过了等度操作之后,用20个柱体积的90％～100％的溶剂B（二元反相体系中较强的溶剂）将会除去这些污染物.（表二列出了各种型号的高效液相色谱柱的柱体积,所以读者可以很轻易地确定色谱柱的冲洗体积.）例如,脂质类的化合物可以使用一些非水性的溶剂来去除,如甲醇、乙睛、四氢呋喃.如果你正在使用含水的缓冲流动相,则千万不能将流动相直接跳到强溶剂中.将流动相猛然间改到高比例有机相的举动会导致高效液相色谱流动体系的缓冲沉淀,这将会造成更加严重的问题,如使筛板堵塞,接口管路堵塞,泵的密封垫失效,刮伤泵的柱塞杆,使进样阀转子失灵.相反,应使用非缓冲的流动相来冲洗色谱柱（就是用水来代替缓冲液）.在经过了5～10个柱体积的非缓冲溶剂冲洗之后才能允许较强的溶剂流经色谱柱.
有时,流动相中的强溶剂组分是不能充分去除色谱柱中的污染物的.必须另外使用一种更强的溶剂或一系列的溶剂才能清洗色谱柱.假如污染物是非生物性的,则使用者可以通过一种或更多的其他有机溶剂来去除不需要的化合物.可以使用许多种的溶剂和溶剂组合方式.访问一些色谱柱生产厂商的网站可以浏览到一些推荐使用的溶剂系统.
一般来说,所有的清洗都会遵循一个相似的模式.清洗过程中的溶剂浓度是增加的,通常最后都是使用一些非极性的溶剂（例如：乙酸乙酯,乃至碳氢化合物）,它将会有助于溶解一些脂质类和油类化合物.重要的是要确保这一系列的每个溶剂都能与所使用的下一个溶剂互溶.一个清洗循环的结论是,在回到初始的流动相系统之前,可通过中间的可互溶的溶剂反向走.例如,异丙醇就是这个中间步骤的一个极好的溶剂,因为它能够同有机溶剂互溶,如正己烷和二氯甲烷,而且同样也能够和水相溶剂互溶.因为异丙醇有很大的粘度,所以必须确保清洗时流速不能太高,否则会引起泵的压力过载.同样,如果使用了紫外检测器,则需避免使用在紫外光谱区有吸收的溶剂,因为这样会需要大量的清洗溶剂才能去除所有吸收的溶剂以得到一个稳定的基线.对于典型的键合硅色谱柱和无缓冲液的流动相的一个推荐使用的清洗系统就是：
l 100％甲醇；
l 100％乙睛；
l 75％乙睛——25％异丙醇；
l 100％异丙醇；
l 100％二氯甲烷；
l 100％正己烷；
当使用了二氯甲烷或正己烷作为冲洗溶剂后,由于溶剂的不互溶性,需要先用异丙醇冲洗色谱柱,而后才能使用含水的流动相.冲洗色谱柱的清洗溶剂的体积最小为柱体积的十倍.对于一根250mm×4.6mm的色谱柱,分析者可以使用经典的1～2mL/min的高效液相色谱流量.为了要回到原来的流动相,色谱工作者可以跳过颠倒使用该系列的清洗溶剂.推荐使用异丙醇为中间的清洗溶剂,然后用不含缓冲液的流动相冲洗,最后再用最初使用的流动相进行冲洗.四氢呋喃是另一个使用广泛的溶剂,它可以被用来清洗受污染的色谱柱.如果使用者怀疑色谱柱受到了比较严重的污染,则可以用二甲亚砜或二甲基甲酰胺与水以50：50的比例,以小于0.5mL/min的流速进行清洗.成功的反向液相色谱柱的再生需要花费相当多的时间,使用溶剂进行冲洗可以设置梯度程序来进行通宵操作.*
在清洗过程中产生了是否应该将色谱柱颠倒过来冲洗的问题.因为大部分的强保留的污染物都会留在色谱柱的前端,将色谱柱颠倒过来清洗会减少已被溶解的污染物流出色谱柱的迁移距离.就填料层的稳定性而言,大部分的现代高效液相色谱柱都是用比普通操作压要高得多的压力装填的；因此,色谱柱的填料层应该不会受到反向的流速的干扰.然而,如果色谱柱顶端的筛板的空隙要比底部的来得大,这种反向的方式则是有害的.比如说,如果底部筛板的空隙为2µm,则足够容纳装填有平均填料粒径为5µm的色谱柱.（含有粒径5±2µm的尺寸分布）.然而生产商往往在色谱柱的顶端安装空隙度比较大的筛板,以防止其被样品或流动相颗粒所堵塞.如果这种筛板的空隙度要比粒径大小分布的最小微粒大,部分填料会经筛板而流出色谱柱,这样就会产生中空.如果色谱柱上有一个箭头来提醒色谱柱的流向,我觉得应该在反向使用色谱柱之前参考说明使用书,浏览生产商的网站,或与技术支持组进行商讨,以确定这是否是一个安全的举动.无论你是否将色谱柱反向使用,最好要将色谱柱同高效液相色谱检测器断开,使污染物或者颗粒留在筛板上而不流经检测池,因为这些物质会污染检测池.
清洗污染的反相色谱柱的频率依懒于有多少不明物质被注射到柱子中,因为反相色谱柱有时在分辨率损失和外来物质的洗脱前可以忍受大量的污染物, 使用者往往等到他们观察到一些异常现象才对柱子进行清洗.然而,长时间累积的污染物会使色谱柱的清洗工作变得更难.正因为如此,如果你知道自己的色谱柱很容易受到脏的样品基体的污染时,我建议定期清洗你的色谱柱.清洗的次数越多,清洗条件也就越简单.
反相硅胶基质色谱柱中残留蛋白质的清洗
如果一些如血浆、血清的生物物质留在了反相液相色谱柱上,色谱工作者必须使用一些不同的清洗程序.在大部分情况下,一些比较纯的有机试剂如乙睛或甲醇是不能溶解肽和蛋白质的,所以它们不能有效清洗反相液相色谱柱.然而加入了缓冲液、酸或者一些离子对试剂的混合有机溶剂能够有效清洗这些物质.起初,可以尝试含比较高浓度的溶剂B的流动相来冲洗色谱柱.
Freiser和他的同事（4）发现来回反复地梯度洗脱,使用三氟乙酸的水溶液和三氟乙酸—正丁醇可以使污染的反相液相色谱柱再生.Bhadway和Day（5）建议进样100µL的三氟乙醇到250mm×4.6mm色谱柱可以达到清洗的目的.如果这些方案都失败了的话,推荐使用Cunico和他的同事们（6）的强洗脱液和溶解性的试剂（见表三）.然而,在用这些试剂冲洗色谱柱之前,应该参考色谱柱的手册,或和生产商进行商议,以确保其不会破坏色谱柱的填料.硅键合色谱柱的填料往往能够与这些试剂共存,而聚合物色谱柱可能会因为与特定溶剂结合而使填料产生膨胀或收缩,从而影响到色谱柱的性能.
表三 用于HPLC反相色谱柱蛋白质物质除去的清洗溶剂
溶剂 组成
乙酸 1%的水溶液
三氟乙酸 1%的水溶液
0.1%三氟乙酸-异丙醇 40：60（V：V）（粘稠的,通常降低流速）
TEA-异丙醇 40：60（V：V）（在三乙胺混合前用0.25N的磷酸调节pH到2.5）
尿素或胍的水溶液 5-8M（调节pH到6-8）
NaCl,Na3PO4,Na2SO4水溶液 0.5-1.0M (Na3PO4 pH 7.0)
DMSO-水 或 DMF-水 50：50（V：V）
来自参考文献6.
如果使用了早期的一系列溶剂,则必须确保表三中的溶剂与这个系列中的溶剂都是互溶的.异丙醇是一个良好的中间冲洗溶剂.在体系中的清洗体积最少为20个柱体积.由于一些溶剂清洗系统具有一定的粘滞性,所以必须调整冲洗流速以避免产生超压.在清洗完一根含有胍和尿素的色谱柱后,需要用至少40～50柱体积的色谱级的水进行冲洗.
对于反相高效液相色谱柱来说使用一些如十二烷基磺酸钠（SDS）和Triton的清洗剂来清洗是不妥的,因为这些化合物会强烈地吸附在硅胶基质的表面而难以去除.这些试剂会影响填料表层,改变填料的性质.然而,分离小组的研究发现,肽合成过程中保护基团和净化剂产物对柱子的污染,可以通过在流动相中注射500µL的1％SDS溶液以1mL/min的流速进行冲洗（7）.如果接下来使用含0.1％(V/V)三氟乙酸的5％～95％乙睛的梯度,在开始的条件下进行平衡,多肽的分离效果则可恢复.
