基因工程技术可生产的药物和制剂包括:
(1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体;
(2)细胞因子,如各种干扰素,白细胞介素,集落刺激生长因子,表皮生长因子,凝血因子;
(3)激素,如胰岛素,生长激素,心素纳;
(4)酶类,如尿激酶,链激酶,葡激酶,组织型纤维蛋白溶酶原激活剂,超氧化物歧化酶.
基因工程药物生产的基本过程
定义:基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体,拼接后转入新的宿主细胞,构建成工程菌(或细胞),实现遗传物质的重新组合,并使目的基因再工程菌内进行复制和表达.
基因工程药物制造的一般流程:
(1)获得目的基因;(2) 组建重组质粒;(3)构建基因工程菌;(4)培养工程菌;(5)产物分离纯化;(6)除菌过滤;(7)半成品检定;(8)包装
1,上游阶段:首先获得目的基因,然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌(细胞),以便大量复制目的基因.选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能,其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易.其中的(1),(2),(3)步骤属于上游阶段,在实验室完成.
2,下游阶段:将实验室成果产业化,商品化,它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数大的确立,新型生物反应器的研制,高效分离介质及装置的开发,分离纯化的优化控制,高纯度纯品的制备技术,生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造,电子计算机的优化控制等.上述(4),(5),(6),(7),(8)等属于下游阶段.
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目的基因的获得
一,逆转录法
逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA,再反转录成cDNA,然后进行cDNA的克隆表达.
1,mRNA的纯化
mRNA的特点:3'末端含有一多聚腺苷酸组成的末端.
方法:亲和层析法
2,cDNA第一链的合成
一般 mRNA都带有3'-polyA,所以可以用寡聚dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的合成.
用放射性探针法检测.
3,cDNA第二链的合成
以cDNA第一链为模板合成第二链.
4,cDNA克隆
用于cDNA克隆的载体有两类:质粒DNA和噬菌体.又将其分为表达型载体和非表达型载体.选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法,有利于目的基因的筛选.
cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法:
加同聚尾连接:在载体和cDNA的3'末端加上互补的同型多聚酶序列.
人工接头连接:所谓人工接头是指用人工合成的,连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断.
5,将重组体导入宿主细胞
6, cDNA文库的鉴定
7,目的cDNA克隆的分离和鉴定
(1)核酸探针杂交法
(2)免疫反应鉴定法
逆转录-聚合酶反应法.该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链,不需再合成第二链,而是在特异引物的协助下,用PCR法进行扩增,特异地合成目的cDNA链,用于重组,克隆.
二,化学合成法
前提:较小的蛋白质或多肽的编码基因,必须知道目的基因的核苷酸排列顺序,或知道目的蛋白质的氨基酸顺序,再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列.
操作:见书
限制:一,不能合成太长的基因.
二,人工合成基因时,遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难.
三,费用高
基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中的转录,翻译以及所有加工过程.
基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动,即剪切下一个外源基因片断,拼接到另一个基因表达体系中,使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物.
一,宿主细胞的选择
宿主细胞应满足的要求:
分类:第一类为原核细胞,如大肠杆菌等;第二类为真核细胞,如酵母等.
1,原核细胞
(1)大肠杆菌:目前采用最多的原核表达体系.
(2)枯草芽孢杆菌
(3)链霉菌
2,真核细胞
(1)酵母:酿酒酵母应用广泛.
(2)丝状真菌
(3)哺乳动物细胞
二,大肠杆菌中的基因表达
1,载体
表达载体必须具备的条件:
(1)载体能够独立的复制
(2)具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记
(3)具有很强的启动子
(4)具有阻遏子
(5)有很强的终止子
(6)有翻译的起始信号
常用的表达载体:
(1)pBV220系统
(2)pET系统
2,影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
(1)外源基因的拷贝数
(2)外源基因的表达效率
①启动子的强弱
②核糖体结合位点
③SD序列和起始密码子ATG的间距
④密码子组成
(3)表达产物的稳定性
(4)细胞的代谢负荷
(5)工程菌的培养条件
3,真核基因在大肠杆菌中的表达形式
(1)以融合蛋白的表达形式表达药物基因
由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质,称为融合蛋白.
(2)以非融合蛋白的形式表达药物基因
(3)分泌型表达蛋白药物基因
三,酵母中的基因表达
1,载体
(1)载体的复制序列 包括YEp类,YRp类,YRp类和YIp类.
(2)克隆载体 由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易,所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的.
(3)表达载体 包括普通表达载体和精确表达载体.
2,影响目的基因在酵母菌中表达的因素
(1)外源基因的拷贝数
(2)外源基因的表达效率 主要与启动子,分泌信号和终止序列有关.
(3)外源蛋白的糖基化
(4)宿主菌株的影响 表达用的酵母宿主菌应具备①菌体生长力强.②菌体内蛋白酶要较弱.③菌株性能稳定.④ 分泌能力强.
四,动物细胞中的基因表达
