谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定
几乎所有植物中都存在淀粉酶,尤其是萌发的禾谷类种子,淀粉酶活性最强.主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶.种子萌发时,淀粉酶活性随萌发时间迅速增加,将淀粉分解成小分子糖类,供幼苗生长.α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键,作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原性糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键,水解产物为麦芽糖,并能使一部分糊精糖化.本实验以萌发种子为材料,测定其中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的差异.
【原理】
两种淀粉酶具有不同理化特性,α-淀粉酶不耐酸,在PH3?6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热,在70℃下15Min则被钝化.据此,在测定时钝化其中之一,就可以测定出另一种酶的活力,本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力,再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较,求出β-淀粉酶活力.淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应,使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸.在一定范围内,其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比,可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示,用比色法测定淀粉生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力.
【仪器与用具】
分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵；具塞刻度试管25Ml 13支,刻度吸管1ml、2ml、5Ml各1支；容量瓶50Ml 2支.
【试剂】
麦芽糖标准液(1Mg／Ml)：称取100Mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100Ml.
DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20Ml 12Mol／L NAOH溶液中,加入50Ml蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水定容至100Ml.盖紧瓶塞,勿使CO2进入.若溶液混浊,可过滤后使用.
1Mol／L PH5?6的柠檬酸缓冲液：A液(0?1Mol／L柠檬酸)：称取分析纯柠檬酸21?01g,用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0?1Mol／L柠檬酸钠）：称取柠檬酸钠29?41g用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55Ml与B液145Ml混匀,即为0?1Mol／L PH5?6的柠檬酸缓冲液.
1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100Ml 1Mol／L PH5?6的柠檬酸缓冲液中.
【方法】
1.酶液提取称取25℃下萌发3～4天的小麦种子1?0g(芽长1?5CM),置研钵中,加少量石英砂和2Ml蒸馏水,研磨成匀浆后转入离心管中,用7Ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管,提取液在室温下放置提取15～20Min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取.然后在3000r／Min转速下离心10Min,将上清液倒入50Ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液.吸取上述淀粉酶原液5Ml,放入50Ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度摇匀,即为淀粉酶稀释液.
麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表18-1加入试剂：
表18-1制作麦芽糖标准曲线配方表
试剂管号1234567麦芽糖标准液（ml)00.20.40.81.21.62.0蒸馏水（ml)2.01.81.61.20.80.40麦芽糖含量（mg)00.20.40.81.21.62.03,5-二硝基水杨酸（ml)2222222摇匀,置沸水浴中煮沸5Min.取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20Ml.以1号管作为空白调零点,在540nM波长下比色测定.以麦芽糖含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线.
酶活力的测定取6支干净的具塞刻度试管,编号,按表18-2进行操作.
表18-2酶活力的测定配方表
操作项目管号Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3淀粉酶原液（ml)1.01.01.0000钝化β-淀粉酶置70℃水浴中15Min,取出后在流水中冷却淀粉酶稀释液（ml)000111DNS试剂（ml)2.0002.000预保温40℃恒温水浴中保温10Min1%淀粉溶液（ml)(40℃)1.01.01.01.01.01.0保温40℃恒温水浴中准确保温5MinDNS试剂（ml)02.02.002.02.0摇匀,置沸水浴中5Min,取出后冷却,加蒸馏水至20Ml,摇匀,在540nM波长下比色,记录测定结果.
结果计算 用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg),再按下式计算α-淀粉酶的活力(Aα),淀粉酶活性以每克鲜重所含麦芽糖毫克数(Mg／g·Min)表示：
Aα＝CαVTFW×t×V1（18-1）
Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg),按式18-1计算(α＋β)-淀粉酶的活性AT?
AT＝CT×VTFW×t×V1
式中A:淀粉酶活性,Aα为α-淀粉酶的活性,AT为淀粉酶总活性,主要是α、β-淀粉酶的活性；
Cα:α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(查标准曲线求值,以下同)；
CT:(α＋β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量；
V1:显色所用酶液体积(Ml)；
T:酶作用时间(Min)；
VT:样品稀释液总体积(α-淀粉酶为50Ml,α＋β淀粉酶为500Ml)；
FW:样品鲜重(g).
【思考题】
1.萌发种子和干种子α-淀粉酶和β-淀粉酶活力有何差异?这种变化有何生物学意义?
实验中设置对照的意义何在?
α-淀粉酶和β-淀粉酶性质有何不同?作用特点有何不同
