在涂抹法与压碎法中,醋酸洋红常被用作核、染色体的固定和染色剂.在煮沸的45％醋酸中加洋红使之饱和,再加入微量的铁离子,便使醋酸洋红材料在为醋酸固定的同时,洋红将核或染色体染成红色.
植物细胞有丝分裂
一、实验目的
(1) 学习和掌握植物根尖细胞压片技术.
(2) 观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化.
二、实验原理
有丝分裂是植物细胞增殖的主要方式,在有丝分裂过程中,细胞核内的染色体能准确地复制,并能有规律地均匀分配到两个子细胞中去,使子细胞遗传组成与母细胞完全一样.从而可推断生物性状的遗传与染色体的准确复制和均等分配有关,支配生物性状的遗传物质主要存在于细胞核内的染色体上.
高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织,根尖取材容易,操作和鉴定方便.通过对根尖的固定、染色和压片,可在显微镜下观察到大量处于有丝分裂各个时期的细胞和染色体,看到染色体的变化特点和染色体的形态特征,进行染色体计数.为了获得更多的中期染色体图像,可以采用药物处理或冷冻处理的方法,阻止纺锤体的形成,使细胞分裂停止在中期,同时还可以使染色体缩短,易于分散,便于观察研究.另外,通过对细胞组织进行酸性水解或酸处理除去细胞之间的果胶层,并使细胞软化,便于细胞彼此分开,有利于压片和染色.
三、实验材料
小麦 ( Triticum Spp ． ) 、玉米 ( Zea mays ) 、大蒜 ( Aillumsativum ) 、洋葱 (Aillum cepa ) 、蚕豆 (Vicia faba ) 等.
四、实验器具和药品
1 ．器具 冰箱,恒温箱,显微镜,水浴锅、分析天平、扭力天平、电炉、温度计、剪刀、镊子、刀片、量筒、量杯、三角瓶、烧杯、漏斗、培养皿、酒精灯、滴瓶、载玻片、盖玻片、滤纸、标签、胶水等.
2 ．药品 无水酒精、 95 ％酒精、 70 ％酒精、 45 ％酒精、 0.5 ％醋酸洋红、 0.5 ％苏木精液、 4 ％铁明矾液、苯酚,亚硫酸、二甲苯、秋水仙素、对二氯苯、 8- 羟基喹啉、α－溴萘、 lmol/L 盐酸、 25 ％纤维素酶和 2.5 ％果胶酶混合液、加拿大树胶等.
五、实验步骤
1 ．培养
(1) 大蒜和洋葱根尖：将大蒜或洋葱置于盛清水的小烧杯口上,使根茎部与水接触,然后转移到 25 -28 ℃ 的条件下培养．待根尖长到 2cm 左右时,在上午 9 － 10 时剪去根尖约 lcm 备用.
(2) 玉米或小麦,蚕豆根尖：用温水将蚕豆种子浸种 2 天,玉米及小麦种子浸种 1 天,侍吸水膨胀后转移到铺有几层吸水纸的培养皿或塘磁盘中,上面盖双层湿纱布并加入少许水,放在 25 -28 ℃ 条件下培养．待根尖长到 2cm 左右时．在上午 9 一 l0 时或下午 3-5 时取下根尖备用.
2 ．预处理 为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数,在固定之前应对剪下的根尖进行预处理,这样可以改变细胞质的粘度,抑制和破坏纺锤丝的形成．促使染色体缩短和分散.预处理的方法有低温预处理和药物预处理.
(1) 低温预处理：将剪取的根尖浸入盛有蒸馏水的烧杯内,置于 4 ℃ 的冰箱中进行低温处理 24 小时.此法效果很好.对染色体无破坏作用,染色体缩短均匀．简便易行,各种作物都适用.
(2 ) 药物预处理：常用药物有秋水仙素溶液、对二氯苯溶液、 8 —羟基喹啉等.
3 ．固定 借助于物理方法或化学药物的作用,迅速渗入组织和细胞将之杀死,使其形态结构和内含物尽可能保持生活时的完整和真实状态.固定时,将预处理过的根尖用蒸馏水冲洗两次 ( 约 5 分钟 ) .然后移入卡诺氏固定液中,在 4 — 15 ℃ 条件下固定 20 一 24 小时后用 70 ％酒精冲洗 2 次转入 70 ％酒精中．在 4 ℃ 冰箱内保存,保存时间最好不超过二个月．经过较长时间保存的材料,进行观察前可以换用固定液再处理一次效果较好.或将预处理过的根尖放入 0.075mol/L KCI 溶液中低渗 20 分钟．然后在蒸馏水中冲洗 2 — 3 次 ( 约 10 分钟 ) 待用.
4 ．解离 使分生组织细胞间的果胶质分解．细胞壁软化或部分分解．使细胞和染色体容易分散压平.解离有酸解和酶解两种方法：
(1) 酸将根尖从固定液中取出,用蒸馏水漂洗．然后放入已经在 60 ℃ 水浴锅中预热的 1 mol/L HCI 中,在 60 ℃ 恒温条件下解离 10 — 15 分钟,当根尖透明呈米黄色时取出,用蒸馏水冲洗 2 — 3 次.
(2) 酶将根尖从固定液中取出,放在 0.1mol ／ L 醋酸钠中漂洗,用刀片切除根冠以及延长区 ( 根尖较粗的蚕豆,可以把分生组织切成 2-3 片 ) ,把根尖分生组织放到醋酸钠配制的 2.5 ％的纤维素酶和果胶酶的等量混合液中．在 25 — 28 ℃ 条件下处理 4 — 5 小时.此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色,质地柔软而仍可用镊子夹起,用滴管将酶液吸掉．再滴上 0.1 mol ／ L 醋酸钠,使组织中的酶液渐渐渗出,再放入 45 ％醋酸.
5 ．后低渗 将解离后的根尖放在蒸馏水中冲洗 2 — 3 次 ( 约 10 分钟 ) .酶解后的根尖放入蒸馏水中浸泡 10 － 15 分钟,然后再冲洗 2 — 3 次.一定要冲洗干净,否则影响染色.低渗后的根尖放入 70% 酒精后备用.
6 ．染色与压片
(1) 醋酸洋红染色制片：取一处理好的根尖置于载玻片中间,用吸水纸吸去多余的保存液,用刀片将根尖分生组织切 1 ：.将其切成薄片,加一小滴醋酸洋红染色液．约 5 分钟后加盖玻片.用吸水纸放在盖玻片上面,左手按住载玻片,用右手拇指在吸水纸上对准根尖部位施加压力.或用铅笔的橡皮头轻敲盖玻片即可,使材料均匀分散,细胞分离压平.压力要适当,注意不要移动盖片.为增强染色效果,可将载玻片在酒精灯上稍加热,但不使其沸腾.以免染料沉淀.加热的作用不仅可以使材料软化和易于着色．而且可以破坏部分细胞质,使核和染色体有一个比较清爽的背景.如果整个细胞染色较浅,可沿盖片一侧,滴加少许染色液,使其慢慢渗入．放置片刻再进行加热,如此反复进行染色.
醋酸洋红常用于染色体的临时制片,其着色不强,分色效果也不甚佳,故不宜制作永久制片
7 ．境检 压好的片子先在低倍镜下观察,可观察到有丝分裂过程中不同分裂时期的染色体.选取不同分裂时期的典型细胞,换高倍镜观察,注意细胞核及染色体,纺缍体等的变化动态.
