高效液相色谱仪的使用
1.色谱柱它包括空柱和填料.空柱是内壁抛光的不锈钢管,内径为4～5mm,长100～250mm.按气相色谱法中洗涤空柱的方法洗净,用匀浆法填充固定相.将此柱装入仪器的管路中,用柱式机械往复泵输入新鲜脱气的流动相.等基线平直后可用苯、萘、菲的混合试液,用正己烷(含 0.05%甲醇)或甲醇：水(83：17)为流动相测定柱效及分离度塔板数在2～3万/ml以上及分离度在1.5以上者,柱效好.为防止柱污染,常用1个 50mm长,5mm内径,装有硅胶(40-50mm)或立柱相同填料的保护柱(预柱)接在主柱之前,以延长色谱柱的寿命.反相键合相柱用毕.必须用水充分流经,以洗去盐类、酸碱等杂质防止柱生锈及填料中杂质的积聚,再用甲醇流经洗涤使色谱柱获得再生.
2.流动相的洗脱方式配好经脱气的流动相放于贮液瓶中,经过有滤过头、内径2mm的聚四氟乙烯管流入高压泵进入色谱柱,最后自检测器流出或收集或作废液回收.用流动相洗脱的方式有恒溶剂脱洗法(isocratic dlution),即自洗脱开始到结束,溶剂的配比恒定.另一类为梯度洗脱法(gradicnt clution),即使溶剂的极性强度在色谱过程中逐渐增加.须按一定程序不断改变流动相的浓度配比,从而使同一个试样中组分性质相差较小的及较大的都能在一次色谱过程中很好分离,而整个色谱过程缩短.必须注意,梯度洗脱法不能用于分子排阻色谱及用电化学检测的反相高效液相色谱法中.
3.检测器适用于血药浓度的检测器有紫外线吸收,荧光发射和电化学三种.紫外检测器应用于对紫外光有吸收的药物,大多数药物分子对紫外光有吸收,故能较普遍采用,检测限有0.1μg左右.紫外检测器有固定波长型、可变波长型及扫描器,既能使流动相停流作组分的定性定量检测,又能提高测定灵敏度,重现性较好.荧光发射检测器对能产生荧光的药物才能使用.80年代应用激光替代氙灯光源,光强度增加了3~4倍,对某些药物的检测限可达pg级.电化学检测器是由一个碳糊或破碳做成的蒲层电解池.常用于检测儿茶酚胺类及有酚类基团的各种药物和代谢物.流出组分进入2μl的薄层电解池,在一暄电压下电解产生电流,放大后检测,检测限pg级.
4.数据处理现代高效液相色谱仪带有数据处理系统,除记录谱外,还能自动记录峰的保留时间,能自动积分求算峰面积,并能按照预定的程序作有关计算,报告分析结果.
高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法
1 液相色谱仪系统
液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成(如图1所示).对于整个系统而言,柱子、泵和检测器是核心部件,同时也是容易出事故的主要场所.
2 常见问题及解决方法
2.1 针对柱压问题(表1)
柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方,柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关.所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值,而是指压力波动范围在50PSI之间.压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题,但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动相种类相联系.值得注意的是在使用梯度洗脱时,进柱压的平稳缓慢的变化是允许的.
在实际应用中柱压过高可从以下几个方面来考虑[1].首先考虑柱子是否被堵,此时可更换一根新柱子进行检测.
2.2 针对保留时间漂移的问题 [2,3] (表2)
保留时间的改变是很多液相色谱使用者常碰到的问题,其包括了保留时间增大和减小.它的产生与很多原因有关.
2.3 针对异常色谱峰问题[2-4]
异常的色谱峰指的是色谱图中无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况.具体情况与原因分析如表3.
3 高效液相色谱仪的保养[5-7]
3.1 HPLC的日常操作条件
工作温度10～30℃; 相对湿度
