1、预变性（Initial denaturation） 模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟.
2、循环中的变性步骤 循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间
变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败.
3、引物退火（Primer annealing） 退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度.然后在此次实验基础上做出预估.
退火温度对PCR的特异性有较大影响.
4、引物延伸 引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）.但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略
延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp.
5、循环数 大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增.
6、最后延伸 在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链.
其中第2到第4步要循环即变性、退火、延伸都要循环
