我现在要做荧光定量PCR,有3个目的基因,以ACTIN基因作为内参,分析其在根茎、根、茎、叶的表达情况,

1,首先需要根据三个目标基因及Actin的序列设计四对引物,引物设计原则同普通PCR引物,网上有很多介绍的,最好其中一个引物是结构基因部分序列+内含子部分序列这种模式.序列长一些25++,退火温度高一些（一般检测时常会60℃附近做两步法扩增）,尽量选择错配情况少的引物组合.许多软件,如primer primer 5可以协助做引物设计.扩增产物150-200bp左右.有可能不是一次成功的,所以跟导师申请的时候提前说好重新合成引物的可能比较大.
2,从各部位的新鲜样品中提取RNA、检测RNA、反转录不需要说的吧?Trizol试剂是用的很频繁的RNA提取试剂,效果不错.上海生工、大连宝公司的我都用过,都不错.最好买商品化的RNase-free耗材和水.
3,引物合成完了,需要做融解曲线,判断PCR扩增是否具有很好的特异性,如果怎么做条件优化,扩增都不是特异性的,那就需要重新设计引物.怎么做融解曲线网上也有很多教程.
4,如果融解曲线比较漂亮,就可以正式检测你的样品了.
还是建议你改用taqman法做定量分析,SYBR法总不踏实,需要不少实验来证实自己的定量分析数据是特异性扩增的结果.