生物工程下游技术-图文

生物工程下游技术

生物工程下游技术的定义

指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。

实质：是研究如何从混合物中把一种或几种物质分离出来的科学技术。

1. 生化工程分离技术

预处理

结晶干燥

离心法：离心过滤、离心沉降、超离心

萃取法：有机溶剂、双水相、液膜、反胶团、超临界

层析法：凝胶过滤层析、反相层析、亲和、疏水相互作用、聚焦、离子交换

膜分离：微滤、超滤、

反渗透、透析、电渗透

2. 生物物质常用的分离技术

氨基酸 ：结晶和离子交换法

蛋白质和多肽 ：离子交换层析、电泳

糖类 ：吸附层析

脂质：有机溶剂萃取、超临界流体萃取和层析

抗生素 ：有机溶剂萃取、离子交换、结晶和吸附层析

3. 生物分离方法的选择与评价

原则：

步聚少，次序合理，产品规格 （注射，非注射），生产规模 ，物料组成，产品形式，产品稳定性，危害性，物性： 溶解度、电荷、分子大小、功能团、稳定性、挥发性，废水处理

4. 浓缩率：浓缩程度一般用浓缩率(concentration factor) 表达，是一个以浓缩为目的的分离过程的最重要指标。浓缩率为m ，mt=mx则目标产物未得到任何程度的分离纯化。

5. 分离因子：分离因子又称分离系数。产品中目标产物浓度越高，杂质浓度越低，则分离因子越大，分离效率越高。

6. 回收率：无论是以浓缩还是以分离为目的操作过程，目标产物均应以较大的比例回收, 回收率R ：生物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料液和产品溶液的体积分别为VC 和VP 。

1 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？

2 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？

3 分离纯化的回收率与浓缩率如何计算？

4 现代生物分离工程研究方向有哪些特点？

5 分离纯化指标有哪些?

简述pH 对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。

答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH 值可以改善发酵液的过滤特性。（2）氨基酸和蛋白质在酸性条件下带正电，碱性条件下带负电，等电点时净电荷为零，两性物质在等电点下的溶解度最小，等电点沉淀法在生物工业分离中广泛使用。（3）如味精生产，利用等电点沉淀法提取谷氨酸，一般蛋白质也在酸性范围达到等电点；膜分离中可通过调整pH 值改变易吸附分子的电荷性质，减少膜堵塞和膜污染；此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在特定pH 下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤进行。

第二章

1. 预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：

⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。

⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。 ⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）；

2. 预处理的方法

凝聚和絮凝

加热法

调节悬浮液的pH 值

杂蛋白的去处

高价无机离子的去处

助滤剂

反应剂

3凝聚与絮凝：. 凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来, 增大体积以便固液分离。 凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。

凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。

凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１ mm 大小块状凝聚体的过程。

机理：

1）中和粒子表面电荷

2）消除双电层结构

3）破坏水化膜

胶体双电层结构

发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。

正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势。两种相反作用力下，双电层分裂成两部：

1）吸附层或stern 层；2）扩散层。

扩散双电层的结构模型(Gouy-Chapman-Stern model)。

两种相反作用力下，双电层分裂成两部：

1）吸附层或stern 层；2）扩散层。

扩散双电层的结构模型(Gouy-Chapman-Stern model)。

絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm 大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。

机理：架桥作用

采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。

人工合成有机高分子聚合物、天然有机高分子聚合物、无机高分子聚合物

聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点

用量少，一般以mg/L计量；

絮凝体粗大，分离效果好；

絮凝速度快；

种类多，适用范围广。

聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：

存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。 天然有机高分子絮凝剂具有无毒，易生物降解，原料来源广等优点。

天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。

其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。

微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，

由微生物或其分泌物产生的具有絮凝细胞功能的代谢产物。

主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。

微生物絮凝剂和天然絮凝剂最大的优点是安全，无毒和不污染环境。

4. 助滤剂：一种不可压缩的多孔微粒，

菌体可吸附于助滤剂微粒上，降低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。

常用的助滤剂是硅藻土，其次是珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素等。

(1)粒度

根据悬浮液中的颗粒和滤液的澄清度确定，一般颗粒较小的滤饼应采用细小的助滤剂。

(2)助滤剂的品种

根据过滤介质选择助滤剂品种。使用粗目滤网时易泄漏，可选择石棉粉、纤维素；采用细目滤布时，可使用细硅藻土；

(3)用量

间歇操作时，过滤介质表面预涂助滤剂，其厚度应不小于2mm 。连续过滤机中根据过滤速度确定。使用硅藻土时，通常细粒为500g/m3，中等粒度700g/m3,粗粒700-1000g/m3。

5. 反应剂：加入某些不影响目标产物的反应剂，可消除发酵液中的一些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速度。

1）反应剂与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀, 生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，又能使蛋白质凝固，过滤性能上升，沉淀本身可作为助滤剂. 如新生霉素发酵液中加入CaCl2和Na3PO4，生成Ca3(PO4)2沉淀。

2）发酵液中含有不溶性多糖物质时，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。

如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min 后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。

6. 杂蛋白的去除方法

沉淀法

A 等电点沉淀法 （isoelectric precipitation ）

蛋白质的等电点大都在酸性范围内(pH4.0～5.5) ，调节发酵液的pH 到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。

B. 酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉淀

在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子形成沉淀，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等； 在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子形成沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等。 变性

蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质溶解度较小。 加热，

大幅度调节pH 值，

加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。

不足之处：

加热法只适合于对热较稳定的目的产物；

极端pH 值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；

有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。

1. 沉淀法主要包括 盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法等 等。

2. 按照一般的习惯，析出物为晶体时称为 结晶 ，析出物为无定形固体则称为 沉淀 。

3. 影响盐析的因素有：无机盐的种类、溶质（蛋白质等）种类的影响、蛋白质浓度的影响、

温度的影响、pH 的影响。

吸附法

加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。

四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀来吸附蛋白质，利用此法除蛋白质已取得很好的效果。

在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。

1 发酵液为何需要预处理？处理方法有哪些？其简要机理如何？

2 凝集与絮凝过程有何区别？如何将两者结合使用？

3 除去发酵液中杂蛋白常用方法有哪些？

4 简述胶体双电层结构及稳定性机理?

5 什么是助滤剂和反应剂？能列举1-3个应用的例子

1. 盐析法：是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。

2. Ks 盐析：在一定的pH 和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks 盐析法。Ks 盐析法多用于提取液的前期分离工作。

3．β盐析：在一定离子强度下仅改变pH 和温度进行盐析，称作β盐析法。在分离的后期阶段，为了求得较好的分辨率，或者为了达到结晶的目的，有时应用β盐析法。β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢且变化幅度小，沉淀分辨率比K S 盐析法好。

4．亲和沉淀:利用亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来。

四 问答

1. 什么是盐析作用？盐析的原理是什么？

答：盐析作用：向蛋白质溶液中逐渐加入中性盐，在高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小，发生了盐析作用。产生盐析作用的一个原因是由于盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，因此盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。盐析作用的另一个原因是由于中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。

2. 如何选择盐析所用中性盐？

（1）盐析作用要强。一般来说多价阴离子的盐析作用强，有时多价阳离子反而使盐析作用降低。

（2）盐析用盐要有足够大的溶解度，且溶解度受温度影响应尽可能小。这样便于获得高浓度盐溶液，有利于操作，尤其是在较低温度下的操作，不致造成盐结晶析出，影响盐析效果。

（3）盐析用盐在生物学上是惰性的，不致影响蛋白质等生物分子的活性，最好不引入给分离或测定带来麻烦的杂质。

（4）来源丰富、经济。

3. 有机溶剂沉淀的原理是什么？

答：亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

4. 有机溶剂沉淀影响沉淀效果的因素有那些？

答： （1）有机溶剂种类及用量

（2）pH 的影响

（3）温度无机盐的含量

（4）某些金属离子的助沉淀作用

(5)样品浓度

第三章

1. 影响发酵液固液分离的因素

1）发酵液中悬浮离子的大小

2）发酵液的黏度viscosity ：

固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。影响粘度的因素： 菌体的种类和浓度(重要因素)

培养液中蛋白质、核酸大量存在

培养基成分

此外，某些染菌发酵液，如染细菌，则粘度会增大。

发酵过程的不正常处理，如大量过剩的培养基和消沫油加入，都会使粘度增大。

2. 常见的固液分离方法

过滤 filtration

过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差ΔP 作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。

离心 Centrifugation

离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒 加速沉降的分离过程。

扩张床吸附 EBA(Expanded Bed Adsorption)

一种新型的生物分离技术：集成化分离技术，即对已有的两种或两种以上的单元操作进行有效的组合，组成一种有效的单元操作，以达到提高产品收率、缩短纯化步骤、降低纯化费用和投资成本的目的

2. 固液分离过滤设备

按操作方式分类：间歇过滤机、连续过滤机

按操作压强差分类：压滤、吸滤和离心过滤

典型过滤设备：

实验室用抽滤装置

板框压滤机（间歇操作）板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。

转筒真空过滤机（连续操作） 真空过滤设备以大气与真空之间的压力差作为过滤操作的推动力。生物工业中，用得较多的是转筒式真空过滤机和带式真空过滤机。

过滤式离心机:由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤网及滤筐而流出。

2. 离心分离设备优缺点

优点：

分离速度快，分离效率高、

液相澄清度好；

缺点：

与过滤设备相比，设备投资高、能耗大、

离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同。

通常离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体。而过滤可获得的水分含量较低的滤饼。

3. 离心的几种原理类型

（一）差速离心

特点：

介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。

用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。

沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。

可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。

（二）密度梯度离心

用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。

类型：速度沉降、等密度沉降。

常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。

分离活细胞的介质要求：

1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；

2）pH 中性或易调为中性；

3）浓度大时渗透压不大；

4）对细胞无毒。

4. 膨胀床吸附原理和固相分级特性

膨胀床与传统固定床的区别在于：膨胀床的床层上部安装有调节器，当料液或清洗液从床底输入时，吸附剂床层产生膨胀，高度调节器上升，膨胀床状态下床层高度一般为固定床状态的2-3倍，可直接处理菌体发酵液或细胞匀浆液, 提高目标产物收率。

膨胀床与流化床的区别：后者的吸附型粒子和液体在床层内混合程度高，吸附效率低，而前者的吸附剂粒子基本悬浮于固定的位置，液体的流动与固定床相似，接近平推流，吸附效率高。

第四章

细胞破碎的目的:破坏细胞外围，使细胞内容物释放出来。

意义：破碎细胞, 提取其中的各种物质, 分析细胞的结构, 遗传物质的研究, 对人类的发展具有重要的意义。

包含体可用密度梯度离心机收集，收集的包含体用变性剂溶解，再除去变性剂即可得到恢复活性的蛋白质产品。

1. 非机械破碎方法有酶溶破碎法\化学破碎法\去垢剂破碎法\渗透压冲击破碎法\冻融破碎法。

2. 破碎率的测定：直接测定法\目的产物测定法\导电率测定法

3. 基因工程包涵体的纯化过程为____洗涤____ 、_____溶解___和___复性____;

目标蛋白的变性溶解通常使用的变性剂是___盐酸胍__和___尿素__;目标蛋白复性的方法通常有__稀释法___ 、__膜分离法___和__层析法_。

4. 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干；真空干燥多用于细菌，冷冻干燥适用于不稳定的生化物质

5. 细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS ，阴离子型）；。非离子型如Triton X-100和吐温（Tween ）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来

第五章

1. 萃取（Extraction ）指任意两相之间的传质过程。在液液萃取过程中常用有机溶剂作为萃取试剂，因而常常称液液萃取为溶剂萃取。

溶剂萃取法是生物工业中一种重要的分离提取方法。它是利用一种溶质组分（如产物）在两个互不相溶的液相（如水相和有用机溶剂相）中竞争性溶解和分配性质上的差异来进行分离操作的。有机溶剂

萃取法广泛应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物工业规模的提取上。

2. 溶剂萃取法有以下一些优点：比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好、传质快；比蒸馏法能耗低。另外它还有生产能力大、周期短、便于连续操作、容易实现自动化控制等优点。

2. 一个良好的溶剂要满足以下几方面的要求:

①有很大的萃取容量，即单位体积的萃取溶剂能萃取大量的产物；

②有良好的选择性，理想情况是只萃取产物而不萃取杂质；

③与被萃取的液相（通常是水相）互溶度要小，且粘度低、界面张力小或适中；

④溶剂的回收和再生容易；

⑤化学稳定性好，不易分解，对设备腐蚀性小；

⑥经济性好，价廉易得；

⑦ 安全性好，闪点高，对人体无毒性或毒性低。

生物工业上常用的溶剂有酯类、醇类和酮类等.

3、单级萃取

单级萃取是使用一个混合器和一个分离器的萃取操作。

料液F 与萃取溶剂S 一起加入混合器内搅拌混合萃取，达到平衡后的溶液送到分离器内分离得到萃取相L 和萃余相R ，萃取相送至回收器，萃余相R 为废液。

在回收器内产物P 与溶剂分离（如蒸馏、反萃取等），溶剂S 则可循环使用。

目的物在两相中的数量比:

E=K·VS/VF ＝ K/m

其中m 为浓缩比，即: m ＝ VF/VS

令未被萃取的分率为φ，则:

φ= 1/(E+1)

而理论收(得) 率: 1－φ= E/(E+1)

4、多级萃取

1）多级错流萃取

多级错流萃取流程的特点是：每级均加新鲜溶剂，故溶剂消耗量大，得到的萃取液产物平均浓度较稀，但萃取较完全。多级错流萃取流程收率

1－φ＝1－1/(E1+1)(E2+1)…

(En+1)

2）多级逆流萃取

多级逆流萃取流程的特点是：料液走向和萃取剂走向相反，只在最后一级中加入萃取剂，故和错流萃取相比，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率最高。

多级逆流萃取流程收率

1－φ＝(En+1－E)/(En+1－

1)

5. 乳化和去乳化

乳化：是一种液体(分散相) 分散在另一种不相混溶的液体（连续相）中的现象。乳化发生后，两相分层困难，出现夹带现象，影响收率和分离效果。

乳化的结果可能形成两种形式的乳浊液。一种是水包油型（O/W），另一种为油包水型（W/O）。

由蛋白质引起的乳化，构成形式为O/W型，液滴粒径再.5～30微米。

形成稳定的乳浊液，一般应有第三种物质即表面活性剂的存在。乳浊液的稳定性与下列因素有关：

①界面上保护膜是否形成；

②液滴是否带电；

③介质的粘度。

其中①最重要。在发酵液中，蛋白质是引起乳化的最重要的表面活性物质。 表面活性剂亲水性强，乳化时易形成水包油。

表面活性剂疏水性强，乳化时易形成油包水。

6、破乳化

破乳方法：

1）过滤或离心分离破乳法，

2） 化学法（加电解质中和离子型乳浊液的电荷）

3）物理法（加热、稀释、吸附等）

4）顶替法（加入表面活性更大，但因其C 链较短难以形成坚固的保护膜的物质，取代界面上的乳化剂，如戊醇）

5）转型法（如在O/W中加入亲油性乳化剂，使乳化液有生成W/O的倾向，但又不稳定，从而达到破乳目的）

7. 浸取：用某种溶剂把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程称为浸取，也称之为浸出。

溶剂从固体颗粒中浸取可溶性物质的过程一般包括以下一些步骤：

1）溶剂从溶剂主体传递到固体颗粒的表面；

2）溶剂扩散渗入固体内部和内部微孔隙内；

3）溶质溶解进入溶剂；

4）通过固体微孔隙通道中的溶液扩散至固体表面并进一步进入溶剂主体。

其中，第3和4步是浸取过程总速率的控制性步骤。

溶质从固体内部向溶剂主体的传递受各种因素的影响。包括几个方面：

1）通常情况，为普通的扩散传递。

2）对于生物大分子，传递通道的空间尺度影响较大。

3）溶液中的凝胶物质形成的框架结构会影响分子的扩散。

4）在固体内部的分子扩散包含两种不同的机理（溶解扩散和多孔内扩散）。

8、分配定律和分配系数

从料液中提取出来的物质称为溶质；

用来萃取产物的溶剂常称为萃取剂；

溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液称为萃取液；

被萃取出溶质后的料液称萃余液。

在一定温度一定压力的条件下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中，达到平衡时溶质在两相中的活度之比为一常数，这个现象即为分配定律，比例常数为分配系数。 分配定律成立的条件：

1）稀溶液

2）溶质对溶剂互溶性没有影响

3）必须是同一分子类型

不同溶质在不同溶剂中有不同的K 值。K 值越大，表示该溶质在上层液相中溶解度愈大，K 值越小，表示该溶质在下层液相中溶解度愈大。

9. 分离因数

含有两个及两个以上的溶质时，萃取剂对溶质A 和B 分离能力的大小可用分离因数(β) 来表征：

β=( C1A/C1B)/(C2A/C2B)=( C1A/C2A)/(C1B/C2B)

=KA/KB

式中：C 代表浓度，下标1、2 代表萃取相和萃余相，A 、B 为溶质。

如果A 是产物，B 为杂质，分离因数可写为：

β ＝ K产/K杂

β越大，A 、B 的分离效果越好，即产物与杂质越容易分离。

10. 弱电解质表观分配系数

（1）pH 值

如果溶质是弱酸，表观分配系数为 K = K0[H+]/(Kp＋[H+])，如果是弱碱，则K = K0Kp/(Kp＋[H+])。可见pH 直接影响表观分配系数。

pH除影响K 外，还可能对选择性有影响。

pH值还应尽量选择在使产物稳定的范围内。

（2）温度

温度会影响生化物质的稳定性，所以一般在室温或低温下进行。

温度会影响分配系数K ，因为温度通过影响溶质的化学位而影响溶质在两相中的分配 。

（3）盐析

无机盐类可降低产物在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相中。 无机盐类还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。

盐析剂用量要适宜，用量过多也有可能促使杂质一起转入溶剂相，同时还要考虑其经济性，必要时要回收。

（4）带溶剂

带溶剂是指这样一种物质，它们能和产物形成复合物，使产物更易溶于有机溶剂相中，提高分配系数K ，该复合物在一定条件下又要容易分解。

第七章

1. 双水相系统

双水相系统就是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于水中而形成溶液时，由于聚合物溶液间或聚合物与无机盐溶液间具有不相容性，致使当聚合物和无机盐的浓度达到一定值以上时，就会分成互不相溶的两相系统，由于其共同溶剂是水，就称此系统为双水相系统。常见的用于生物物质分离的聚合物/聚合物系统有聚乙二醇（ PEG）/葡聚糖，聚合物/无机盐系统有PEG/磷酸盐，PEG/硫酸铵等。相对于葡聚糖来说，无机盐价格便宜，所以聚合物/无机盐系统在工业应用上具有更为广阔的前景。

2. 要成功地运用双水相萃取方法，应满足下列条件：

1）欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；

2）酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到较高的收率；

3）两相用离心机很容易分离。

3. 相图

水溶性两相的形成条件和定量关系常用相图来表示。图1所示是由两种聚合物和水组成的体系（如 PEG /Dextran体系，这两种聚合物都能与水无限混合），以聚合物PEG 的浓度（重量％）为纵坐标，以聚合物Dextran 的浓度（重量％）为横坐标所作相图。只有在这两种聚合物达到一定浓度时才会形成两相。

图中曲线TCB 把均匀区域和两相区域分隔开来，称作双节线。处于双节线下面的区域时是均匀的，当它们的组成位于上面的区域时，体系才会分成两相。例如，点M 代表整个系统的组成，轻相（或上相）组成用T 点表示，重相（或下相）组成用B 点表示。T 、M 、B 三点在一条直线上，其连接的直线称系线。

第九章

膜分离：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。

浓差极化：是指但溶剂透过膜，而溶质留在膜上，因而使膜面浓度增大，并高于主体中浓度。

1. 膜分离过程中所使用的膜，依据其膜（孔径）不同可分为（微滤膜） ，（超滤膜），（纳滤膜）和（反渗透膜）。

2．工业上常用的膜装置有（板式） ，（管式），（螺旋卷式）和（中空纤维式）。

3. 根据膜结构的不同，常用的膜可分为（对称性膜）、（非对称膜）和（复合膜）三类

4. 膜的污染主要有两种情况，一种是 化学污染 ；另一种是 物理污染 。

1. 区分渗透与反渗透？举例说明反渗透的应用。

答：渗透是由于存在化学势存在梯度而引起的自发扩散现象。

因此，通常情况下，μμ?o

其结果是水从纯水一侧透过半透膜向溶液侧渗透，使后者的液位抬高。

如果在溶液一侧施加压力1P

，外界力做功使溶液中水的化学势升高，则纯水通过膜的渗透就会逐渐减小，并最终停止（条件？），此时的压力差就是溶液的渗透压π。 当π>-01P P 时，水将从溶液一侧向纯水一侧移动，此种渗透称之为反渗透。

2. 膜分离过程中，有那些原因会造成膜污染，如何处理？

答：（1）膜污染主要有两种情况：一是附着层被滤饼、有机物凝胶、无机物水垢胶体物质或微生物等吸附于表面；另一种是料液中溶质结晶或沉淀造成堵塞。（3分）

（2）膜污染是可以预防或减轻的，措施包括料液预处理、膜性质的改善、操作条件改变等方式。（2分）

（3）膜污染所引起的通量衰减往往是不可逆的，只能通过清洗的处理方式消除，包括物理方法冲洗和化学药品溶液清洗等。（2分）

1. 膜分离技术的类型和定义？

答：膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径大小而达到物质分离的目的，故而可以按分离粒子大小进行分类：

（1）微滤：以多孔细小薄膜为过滤介质，压力为推动力，使不溶性物质得以分离的操作，孔径分布范围在0.025~14μm 之间；

（2）超滤：分离介质同上，但孔径更小，为0.001~0.02 μm ，分离推动力仍为压力差，适合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质；

（3）反渗透：是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在0.0001~0.001 μm 之间；（由于分离的溶剂分子往往很小，不能忽略渗透压的作用，故而成为反渗透）；

（4）纳滤：以压力差为推动力，从溶液中分离300~1000小分子量的膜分离过程，孔径分布在平均2nm ；

十二章

1. 亲和层析的原理

利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。 载体-间隔臂-配基-配体

特点

亲和层析的分辨率高。

亲和层析法操作步骤少，操作条件温和，生物大分子的活力不易丧失，回收率也高。 适合于含量少又不稳定的生物活性物质的分离与纯化。

要分离一种物质必须找到适宜的配基，并将其制成固相载体之后方可进行。

2. 影响亲和作用的因素：

离子强度

pH 值

抑制氢键形成的物质

温度

金属螯合剂等

在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。配基必须偶联于载体或担体上，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。

3. 理想的载体应满足下面的要求：

1．极低的非特异吸附性；2．高度的亲水性；

3．较好的理化稳定性；

4. 大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配基结合；

5．适当的多孔性(即孔径大小和孔多少) ，最好为粒径均一的球形粒子。

4. 优良的配基须具备两个条件：

1）与纯化的物质有较强亲和力

2）具有与载体共价结合的基团

该基团和载体结合后，对配基与配体的亲和力没有影响或影响不明显。

5. 手臂：如果在配基与载体之间连接手臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。

常用的手臂化合物：

乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2

已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2

6-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH ， 环氧氯丙烷

1，4- 丁二醇缩水甘油醚

6. 提高亲和吸附剂的操作容量的方法

手臂

增加配基浓度

7. 亲和色谱中为何要引入手臂

当配基分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和作用。

如果在配基与载体之间连接手臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。

加入手臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易由疏水性非特异吸附造成弯曲，反而降低吸附效率。

手臂的疏水性也需要考虑，应尽量减小对配基的影响。如手臂和配基疏水性都较强，则效果不明显。

8. 凝胶层析

凝胶层析是按照被分离物质分子大小, 经过具有一定孔径的多孔物质进行分离的一种方法。其又称为凝胶过滤或分子筛过滤或排阻层析。

洗脱体积（Ve ）：

即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱液的总体积。

1. 过饱和溶液的形成方式有：（饱和溶液冷却），（部分溶剂蒸发），（化学反应结晶法）和（解析法）。

2. 在结晶操作中，工业上常用的起晶方法有（自然起晶法），（刺激起晶法）和（晶种起晶法）。

3. 晶体质量主要指（晶体大小），（晶体性状）和（晶体纯度）三个方面；

4. 结晶包括三个过程： 形成过饱和溶液 、 晶核形成 和 晶体生长 。

5. 工业生产中通常采用加入 晶种，并将溶质浓度控制在养晶区，以利于大而整齐的晶体形成。结晶过程应尽量控制在介稳区内进行，以得到平均粒度较大的结晶产品，避免产生过多晶核而影响最终产品的粒度。

6. 喷雾干燥法制备 微胶囊 。

软水无盐水制备 P 244-246