1936年12月12日,张学良和杨虎城发动了西安事变,在西安扣留了蒋介石,迫使其“停止内战,联共抗日”,蒋介石被迫接受.日本军队于1937年7月7日制造卢沟桥事件,导致中日战争（抗日战争）全面爆发.
七七事变后,建立了国民党、共产党合作抗日民族统一战线,蒋介石积极部署和指挥中国军队开赴华北和淞沪前线,抗御日本侵略军,他先后指挥了淞沪会战、太原会战、徐州会战、武汉会战等重大战役.至1938年10月,使日军伤亡45万余人,粉碎了日本帝国主义妄图速战速决、迅速灭亡中国的战略计划.蒋介石在政治民主化方面作出一些许诺,释放政治犯,召开国民参政会等,全国一时出现一片团结抗日的新气象.但由于蒋介石实行片面抗战路线和单纯军事防御的战略战术,又幻想并等待国际“调停”制止日本侵略,因而不能抵御占有很大优势的日本侵略军,华北、东南和华中大片国土相继沦陷.
1941年12月太平洋战争爆发后,蒋介石积极开展外交活动,与美、英同盟,任中国战区最高统帅,得到了美国的物资和财政援助.他派中国远征军去缅甸,与英美联军联合作战,打通了中印公路.美、英为了联合中国共同抗击日本,许诺废除不平等条约所规定的在华特权,签订了中美、中英“新约”.1943年11月,蒋介石出席开罗会议,与美国总统罗斯福、英国首相邱吉尔会谈对日联合作战方略及战后和平条件.1945年6月派宋子文等去苏联会谈,8月两国签署了《中苏友好同盟条约》及有关协定.
